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GV3101(pSoup-p19)感受態細胞使用說明書

GV3101(pSoup-p19)：100μl/支  
pGs2（controlvector，10ng/μl)10μl  
保存條件(保質期)：-80℃（12個月）  
基因型  
C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline(pSoup-p19-tetR)  
產品說明  
p19蛋白來源于番茄叢矮病毒，可抑制宿主對外源基因的RNA沉默效應，提高異源基因轉錄本的穩定性，進而促進異源蛋白的表達，廣泛應用于轉基因植物及煙草葉片，擬南芥葉片，番茄葉片或原生質體的瞬時表達系統中。GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉入help質粒：pSoup-p19即為GV3101(pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2等質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。本公司生產的GV3101(pSoup-p19)化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>103cfu/μgDNA。  
操作方法  
1.取-80℃保存的農桿菌感受態于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。  
2.每100μl感受態加入0.01-1μg質粒DNA（轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。  
3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時。  
4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50μg/mlkan時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50μg/mlkan，20μg/mlrif時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif則需要28℃培養72-90h）。  
注意事項  
1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。  
2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量，本公司生產的GV3101(pSoup-p19)化學轉化感受態細胞具有四環素抗性，但在轉入目標質粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標質粒抗性的抗生素，不加四環素。  
3.平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。  
4.利福平濃度不應高于25μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。  
5.培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。
備注

1、農桿菌相關抗生素配方：
抗生素 配方 原液 工作液
羧芐青霉素（carb） 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 50 mg/ml 50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan） 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 50 mg/ml 50 μg/ml
鏈霉素（strep） 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 10 mg/ml 50 μg/ml
利福平（rif） DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 10 mg/ml 20 μg/ml
慶大霉素（gent） 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 20 mg/ml 40 μg/ml
 
2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
農桿菌菌株 羧芐青霉素(carb) 鏈霉素(strep) 利福平(rif) 慶大霉素(gent) 硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1 R S R S S
EHA101 S S R S R
EHA105 S S R S S
LBA4404 S R R S S
GV3101 S S R R S

3、LB及YEB配方：
component LB(液體)/L LB(固體)/L component YEB(液體)/L YEB(固體)/L
Tryptone 10 g 10 g Tryptone 5 g 5 g
Yeast extract 5 g 5 g Yeast extract 1 g 1 g
NaCl 10 g 10 g 牛肉浸膏 5 g 5 g
NaOH  調PH到7.0 調PH到7.0 蔗糖 5 g 5 g
Agar － 15 g MgSO4*7H2O 0.49 g 0.49 g
      NaOH  調PH到7.0 調PH到7.0
      Agar － 15 g