GV3101 Elec: 50μl/支
pCAMBIA2301(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質期): -80℃(12個月)
基因型
C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline
產品說明
GV3101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽:gent,賦予GV3101菌株慶大霉素抗性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。本公司GV3101電轉感受態特別適用于大質粒的轉化:經pCAMBIA2301質粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA;經pCAMBIA2301-ZH質粒 (size:40 kb)檢測轉化效率可達5×103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質粒DNA(體積不大于6ul,感受態轉化效率較高,第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量),用手撥打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態-質粒混合物快速移到電擊杯中,蓋上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中,28℃振蕩培養2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養箱培養2-3天
(當平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培養60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h)。